问题
问答题
试述探针的种类及其制备。
答案
参考答案:根据核酸分子探针的来源和性质,可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针。
(1)基因组DNA探针:从基因组文库中筛选得到一个特定基因(或基因片段)的克隆后,大量扩增、纯化,即可作为探针使用,但这些片段可能含有内含子序列。
(2)cDNA探针:由于cDNA中不存在内含子及其他高度重复序列,因此是一种较为理想的核酸探针。以mRNA为模板,在逆转录酶作用下,合成cDNA后,将其克隆于适当的载体上,通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量扩增。制备质粒后,用限制酶切割重组质粒,将cDNA片段切割下来。分离纯化,即可作为探针使用。
(3)RNA探针:将目的基因克隆到带有SP6或T7启动子的质粒中,插入到启动子下游。再用适当的限制酶在插入序列的下游切断质粒,使其线性化,加入RNA聚合酶、4种NTP,其中一种为α-32P标记的NTP。以目的基因的DNA为模板,体外转录出高放射性活性的RNA探针。
(4)寡核苷酸探针:根据已知的核苷酸序列,采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段,亦可作为探针使用。若核苷酸序列未知,可根据蛋白质的氨基酸序列推导出核苷酸顺序,合成相应的寡核苷酸片段作为探针。寡核苷酸片段长度大多在15~30个核苷酸之间。