问题
问答题
PCR引物设计应遵循哪些原则
答案
参考答案:引物长度一般为15~30个核苷酸。(2)碱基随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶的堆积现象。GC的含量为45%~55%。正向和反向引物具有相似的Tm值。Tm=4(G+C)+2(A+T)。引物长度要确保解链温度不低于54℃。(3)避免形成发夹结构,引物自身存在的连续互补序列,一般不超过3 bp。(4)两个引物之间不应存在互补序列,尤其应避免3’端的互补重叠。(5)引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。(6)引物3’端碱基一定要与模板DNA配对,最佳碱基选G和C。(7)引物的5’端可以修饰,如加限制酶位点,引入突变位点、起始密码子 、终止密码子等。