问题
问答题
随机引物法和切口平移法是如何对探针进行标记的
答案
参考答案:(1)随机引物法:随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡核苷酸片段群体,含有各种可能的排列(46=4096),原理是利用随机引物能与各种单链DNA模板结合,作为合成新链的引物,在DNA聚合酶作用下,依照碱基互补原理,按5’→3’方向合成新的DNA链;在合成时,加入的4种反应底物dNTP中有一种是带有标记的,经纯化后,新合成的DNA为被 标记的探针。
(2)切口平移法:利用DNaseⅠ在DNA双链上随机切割单链,造成单链切口,切口处产生5’末端和3’末端5’末端由5’→3’外切酶(DNA聚合酶I的外切酶活性)发生水解反应,3’末端作为引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下,依次将dNTP连接到切口的3’-OH上,以互补的DNA链为模板合成新的DNA链,如反应体系中有标记的dNTP,则此标记的核苷酸将掺入新合成的DNA中,形成DNA探针。