问题 问答题

设计构建一个载体,将目的基因在植物根系表达并向根细胞外分泌。请详细写出各步骤。

答案

参考答案:(1)目的基因获取:若目的基因序列已知,直接设计相应引物,通过RT-PCR扩增该基因的cDNA序列:如目的基因序列未知,可根据其相似物种的同源基因的保守区设计引物,RT-PCR扩增得到目的基因cDNA序列。此外,如果该基因的产物氨基酸序列已知,可以反推出简并性mRNA序列,进而设计引物克隆得到cDNA序列。
(2)目的基因克隆:将PCR产物与TA克隆载体连接后,通过酶切实验对重组质粒进行验证。验证无误后将重组质粒导人大肠杆菌感受态细胞,筛选阳性克隆,扩增目的基因。
(3)表达载体构建:
1)选择一个合适的真核表达载体,如pBI121、pCAMBIA等。通常该载体应含有多克隆位点、启动子、报告基因、抗性基因、蓝白斑筛选标记等必需组分。
2)载体特异要求:若让目的基因在植物所有组织细胞中表达,则选用载体自带的强启动子;若让目的基因只在根细胞中表达,则可以克隆一个植物根细胞特异性表达基因的启动子,连入表达载体作为目的基因的启动子;目的基因产物属分泌型,需要在表达载体中目的基因前端连入合适的信号肽序列。
(4)阳性重组质粒鉴定:将已构建的表达载体导入大肠杆菌中筛选阳性克隆,通过酶切、PCR、测序等方法均可鉴定阳性重组。
(5)转化植物细胞:将阳性重组质粒导入植物细胞。可选直接基因转移技术(包括基因枪法、原生质体法、花粉管通道法、PEG介导转化方法等)或牛物介导转化法(主要有农杆菌介导和病毒介导),其中农杆菌介导广泛应用于双子叶植物的遗传转化。
(6)筛选阳性克隆:PCR检验目的基因是否已导入靶细胞,也可用生化方法检验目的产物的表达。
(7)植物组织培养:获得植株,最后收集产物。

材料题
多项选择题