问题 问答题 简答题

简述斑点杂交的过程。

答案

参考答案:

斑点杂交是一种DNA杂交法,它是将DNA待测样品直接点加在硝酸纤维素膜上使其成为斑点,然后与特异DNA探针进行杂交,以分析DNA样品之间的同源性。

斑点杂交的过程是:

(1)取硝酸纤维薄膜一张,铺在一描有小方格的纸上,以确定点样位点,每格中最多可点样品DNA10μl。

(2)加样可分多次进行,待前一次样品干燥后再加第二次,每次约1~2μl,这样可避免斑点扩大。

(3)待样品干燥后,让硝酸纤维素薄膜漂浮在0.5MNa0H、1.5MNaCl液面上,变性15min。

(4)取出薄膜在滤纸上吸干。

(5)再漂浮在0.5MTris-HCL(pH7.5)、1.5MNaCl液面上中和15min。在滤纸上晾干后,夹在两张纸之间,80℃烘干2h,即可进行杂交。

(6)同位素探针的杂交:①将杂交膜以6×SSP浸润2min;②将湿润的杂交膜装人杂交袋,加人预杂交液,置42℃水浴2~6h;③将已标记的双链DNA探针于95℃~100℃加热5~10min后冰浴骤冷;④向杂交袋中加入已变性的标记探针,置42℃水浴摇床杂交6~12h;⑤小心取出杂交膜并洗膜;⑥干膜。

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