实时荧光定量PCR检测HCV-RNA，室间质评的5个样本定量结果均低于靶值。

如果以上因素均已排除，首要考虑的因素是（）

A.标准曲线的制定

B.温度

C.标志物的活性

D.加样枪的校准

E.离心机的校准

轨向偏差和高低偏差为20m弦测量的最大矢度值。