请扼要说明聚合酶链反应(the polymerase chain reaction,PCR)的基本原理。
参考答案:
PCR技术是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K. B. Mtdlis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。它可以在试管中建立反应,经数小时之后,就能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万倍,乃至千百万倍,而无需通过繁琐费时的基因克隆程序,便可获得足够数量的精确的DNA拷贝,所以有人亦称之为无细胞分子克隆法。
PCR技术快速敏感,简单易行,其原理并不复杂,与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子,然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)合成新生的DNA互补链。此外,DNA聚合酶同样需要有一小段双链DNA来启动(“引导”)新链的合成。因此,新合成的DNA链的起点,事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。这是PCR的第一个特点,即它能够指导特定DNA序列的合成。
在为每一条链均提供一段寡核苷酸引物的情况下,两条单链DNA都可作为合成新生互补链的模板。由于在PCR反应中所选用的一对引物,是按照与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的,因此每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始,并沿着相反链延伸。这样,在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点。然后反应混合物经再次加热使新、旧两条链分开,并加入下轮的反应循环,即引物杂交、DNA合成和链的分离。PCR反应的最后结果是,经几次循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA分子数,即两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数,理论上的最高值应是2n。这就是PCR技术的第二个特点,即使特定的DNA区段得到了迅速大量的扩增。