参考答案：

革兰氏染色的步骤：

①涂片，固定；②

初染：滴加草酸铵结晶紫染色1-2min，水洗；③

媒染：滴加革兰氏碘液（碘-碘化钾溶液）染色1-2min，水洗；

④脱色：滴加体积分数为95%的乙醇，约45s后水洗；

⑤复染：滴加番红染液染色2-3min，水洗并使之干燥；

⑥镜检：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

革兰氏染色的原理：

①革兰氏染色与细菌等电点有关系：革兰氏阳性菌的等电点比革兰氏阴性菌低，因而革兰氏阳性菌带负电荷比革兰氏阴性菌多，它与草酸铵结晶紫的结合力大，用碘-碘化钾媒染后，两者等电位均降低，但革兰氏阳性菌等电位降低得多，故与草酸铵结晶紫结合得更牢固，对乙醇脱色的抵抗力强，草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物不被乙醇提取，菌体呈紫色，而革兰氏阴性菌则相反，菌体呈红色。

②革兰氏染色与细菌细胞壁有关：革兰氏阳性菌的脂质含量很低，肽聚糖含量高，革兰氏阴性菌则相反，因此用乙醇脱色时，革兰氏阴性菌的脂质被乙醇溶解，增加细菌细胞壁的孔径及其通透性，乙醇容易进入细胞内将草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物提取出来，使菌体呈无色，革兰氏阳性菌由于脂质含量极低，而肽聚糖含量高，乙醇既是脱色剂又是脱水剂，使肽聚糖脱水缩小细胞壁的孔径，降低细胞壁的通透性，阻止乙醇分子进入细胞，草酸铵结晶紫、碘-碘化钾复合物被截留在细胞内而不被脱色，仍呈紫色。