DNA复制和蛋白质合成均要求高度的忠实性。请问它们各有何机制保证其合成的忠实性
参考答案:
解析:1.生物体DNA复制具有高度真实性,复制107~1011碱基对中只有一个错误碱基。如果根据核酸相互作用的测定,碱基对自由能通常在4~13kJ/mol。这样的自由能相当于平均掺入100核苷酸即可能出错一次。仅靠Watson-Crick双螺旋的碱基配对原则,突变率将高达10-2。而实际上突变率要低得多。生物体主要是靠以下机制来保证DNA复制的真实性的:
(1)DNA聚合酶的碱基选择作用。DNA聚合酶能够依照模板的核苷酸,选择正确的dNTP掺入到引物末端,这称为DNA聚合酶的碱基选择作用。选择作用的机制还不清楚,但已有三种假说,一是“酶的被动论”,二是“酶积极参与理论”,三是“动力学校正阅读”。
“酶的被动论”认为不论正确的或错误的核苷酸,当它们结合到DNA聚合酶的活性部位上时,都以相同的速度插入到3′-OH末端上,Vmax相同,但是亲和性不同,因此在聚合位点停留的时间不同,正确的dNTP能长时间停留而参与聚合反应。
“酶积极参与理论”认为,DNA聚合酶对正确与错误核苷酸不仅亲和性不同,而且把它们插入到DNA引物末端的速度也不相同,即DNA聚合酶利用了Km和Vmax来区别正确与错误的核苷酸。这是通过酶的构象改变来达到的。但是DNA聚合酶在催化DNA合成时如何改变构象,构象变化又如何影响酶对dNTP的选择性还不清楚。
“动力学校正阅读”认为在DNA合成时有一种中间状态,在新的磷酸二酯键尚未形成时,dNTP结合在酶与模板-引物复合物的聚合位点上,DNA聚合酶能识别正确与错误的dNTP,正确的将形成磷酸二酯键,错误的将排出聚合位点,并以正确的dNTP代替它。目前一般更接受“酶的积极参与理论”。
(2)DNA聚合酶对底物的识别作用。DNA聚合酶有两种底物,一是DNA模板-引物,另一是dNTP的2价离子复合物。DNA聚合酶与dNTP结合的解离常数Kd约数十微摩尔,当加入模板引物时,dNTP与DNA聚合酶的亲和力(Km表示)只有几微摩尔,降低一个数量级。而如果是错误的底物dNTP,则Km比Kd值大,说明模板一引物的结合可以影响dNTP与酶的亲和力。
新生链的引物末端也影响DNA聚合酶的识别过程。只有引物3′-OH末端正确时,DNA聚合酶才能与dNTP起作用。引物末端不正确,即使dNTP与模板的下一核苷酸互补也不能与DNA聚合酶发生相互作用。这是因为DNA聚合酶先识别DNA模板和引物的3′末端,再识别底物dNTP,因此是一种有序的识别过程。这种有序的识别过程表明聚合酶与模板一引物正确结合后形成一个更有利于dNTP结合的立体结构。与模板的下一个核苷酸互补的dNTP结合后,使酶与DNA、dNTP结合得更牢固。这是酶的立体结构发生变化的结果。
(3)3′→5′外切活性的校正阅读。DNA聚合酶的重要功能之一是校正错误碱基,研究得最多的是E. coli聚合酶Ⅰ的Klenow片段。酶的3′→5′外切活性可以删除引物3′末端错误插入的核苷酸,称为校正阅读。这一功能对于提高DNA合成的真实性起着重要作用。缺失3′→5′外切活性的大肠杆菌聚合酶Ⅰ催化DNA合成时出现错误几率增高5~50倍。因此,3′→5′外切活性可以使DNA真实性提高1~2个数量级。
(4)错配修复。DNA聚合酶的校对作用(切除错误掺入DNA的碱基)虽然是一道严格的关口,但也有疏漏的可能。因校对的误差概率为10-8,而细胞复制DNA的误差仅10-10~10-11,所以还有一道严格的控制措施。对大肠杆菌的试验证明,这最后一道严格控制是由错配校正酶负责,其作用为错配修复,与DNA聚合酶的校对作用一起构成DNA复制的校正系统。
错配校正酶由基因mutH、mutL和mutS编码,此酶扫描新复制DNA中的错误碱基并切除含有错误核苷酸的单链片段,然后DNA聚合酶在切去DNA单链的缺口中用新的正确核苷酸填满。
2.蛋白质合成的忠实性是由以下机制保证的:
(1)转录的忠实性。贮存在DNA上的遗传信息通过RNA传递给蛋白质,RNA与蛋白质之间的联系是通过遗传密码的破译来实现的。以碱基配对的原则形成RNA链。
(2)翻译的正确性。氨酰RNA酶的专一性,对氨基酸和RNA具高度的选择性,以防错误的氨基酸掺入。RNA准确无误地将所需的氨基酸运送到核糖体上,三叶草型二级结构,通过密码子、反密码子的配对与RNA结合,将其末端所转运的氨基酸运送到延伸的多肽上。RNA上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上的一个氨基酸,这3个核苷酸就成为密码子。翻译时从起始密码子AUG开始,沿着RNA5′到3′端的方向连续阅读密码子,直至终止密码子,生成一条具特定序列的多肽链。新的多肽链中氨基酸的组成和排列顺序决定于其DNA的碱基序列。
(3)氨酰tRNA合成酶具有高度的专一性和水解校正作用。(1)氨酰tRNA合成酶具有高度的专一性,对将要活化的氨基酸及相应的受体(tRNA)皆有高度的选择性。(2)氢酰tRNA合成酶具有水解校正作用,它具有两个活性部位,一个为合成部位,另一个为水解部位。它的校正作用可能是一种叠加的筛网,要通过第一次和第二次筛选。第一次筛选时,比正确氨基酸大的氨基酸,不能进入合成酶的活性部位,从而不被活化;第二次筛迭时,比正确氨基酸小的氨基酸,虽能被活化,但由于不太适合酶的活性部位,活化速度慢。已被活化的错误氨基酸进入水解部位后,即被水解掉,从而保证了蛋白质合成的忠实性。