观察猪小肠绒毛实验成败的关键有4条：①小肠必须新鲜．②小肠内壁必须洗干净．③放大镜的倍数要大一些．④把小肠内外表面都放在清水中．

在观察前，必须先将小肠绒毛纵剖开，这样可以比较仔细的观察小肠的绒毛的结构，如横剖开，还是看不到小肠绒毛的结构．放在清水中的原因是小肠黏膜的表面，有很多环形的皱襞，着生绒毛；采用清水，可由于渗透压的存在造成小肠黏膜吸水膨胀，这样绒毛就看见了，这是实验成功的关键．

故选：D